Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos
Procedimentos gerais para preparação e distribuição de meios de cultura
Usar EPIs para o preparo de meios de cultura (máscaras, jaleco de manga longa e touca). Observar os riscos indicados nos rótulos dos frascos de meios de culturas e de reagentes químicos e fazer uso de EPIs específicos.
Usar vidrarias limpas, secas e sem trincos ou defeitos, feitas em vidro neutro temperado, termo resistente com parede uniforme e reforçado.
Esterilizar a vidraria pelo processo de calor seco (forno Pasteur) 170°C por 120 minutos ou 180°C por 60 minutos.
Usar água destilada, deionizada, ou produzida por osmose reversa na preparação de meios de cultura e soluções.
Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.
Os preparados não comerciais devem ser pesados separadamente em papel manteiga e adicionados em uma única vidraria adequada (normalmente em Béquer), hidratar em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido. Agitar firmemente por alguns segundos até obter uma suspensão homogênea. Escorrer o restante da água pela parede para retirar qualquer material aderente.
Ajustar o pH dos meios preparados não comerciais com solução de HCl e NaOH 0,1N ou 1N. Nos meios contendo Ágar, pesar o Ágar separadamente e acrescentar após o ajuste do pH para não obstruir o eletrodo. O pH dos meios comerciais, normalmente, não precisa ser reajustado mas deve ser verificado a cada lote.
Dissolver os meios líquidos e soluções com agitação e leve aquecimento (não abrir fervura).
Aquecer os meios contendo Ágar até ferver com constante agitação. A parede da vidraria deve estar lisa sem pontos de Ágar. Caso observe pontos, a fervura não foi suficiente para a total dissolução. Retornar ao fogo para finalizar o procedimento.
Sempre que for necessário o aquecimento dos meios, usar vidro termo resistente tipo Pyrex e aquecer sobre a tela de amianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen ou em placa aquecedora.
Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para manipular vidrarias quentes.
Quando for usado o termo “esterilizar em autoclave”, o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121°C. Observar as recomendações contidas no rótulo ou no manual do fabricante.
Sempre que for usado o termo “esterilizar por filtração”, usar membrana composta por ésteres de celulose ou polímeros plásticos e com porosidade de 0,22μm de diâmetro, recomendado para reter partículas bacterianas. A esterilização por filtração é utilizada quando o material e sensível ao calor.
Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados.
Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis.
Os meios devem ser autoclavados com as tampas semiabertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos. Tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.
Controle de qualidade de esterilidade e crescimento
Avaliar sistematicamente os meios de culturas e soluções quanto a qualidade de crescimento, a seletividade, as características bioquímicas diferenciais e as características físicas.
Para o controle de esterilidade, todos os meios confeccionados devem ter no mínimo 10% do lote preparado colocado na estufa 35 ±1°C por 24 horas. Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia.
Para o controle de crescimento, sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização.
Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100% positivas para os controles de qualidade de crescimento realizadas.
Usar cepas de micro-organismos de referência obtidas diretamente de uma coleção nacional ou internacional reconhecida ou culturas comerciais com propriedades equivalentes comprovadas para avaliação de desempenho dos meios de cultura e de outras soluções preparadas no laboratório.
Manter instrução de manutenção e preparo de cultura de trabalho no laboratório. (consultar ISO 11133-1).
Controlar a eficácia da autoclave ou estufa, realizando semanalmente teste biológicos para essa finalidade. Os testes para autoclaves a vapor são os que contêm 106 Geobacillus stearothermophilus e os para estufa de calor seco contêm 106 Bacillus subtilis.
Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados ou vencidos.
Evitar usar meios liofilizados e prontos para uso vencidos; se usar, certifique-se com o controle de crescimento de que realmente está funcionando.
A validade dos meios preparados, mantidos nas condições definidas de armazenamento, deve ser determinada e controlada.
Observar com atenção para as instruções dos rótulos pois, dependendo do fabricante, podem ter o mesmo nome, mas composição diferente e portanto ser diferente a quantidade de meio a ser usada.
Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do meio.
As placas de Petri são de 50, 90 ou 150 mm de diâmetro.
Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricação, número de lote interno do laboratório, data de validade e tipo de armazenamento.
Todos os meios em placa devem ser embalados na posição invertida e em filme plástico PVC transparente e de papel grau cirúrgico para evitar o ressecamento.
Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação formada facilita a proliferação de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos plásticos, procurando tirar o excesso de ar.
A estocagem dos meios deve ser entre 2 e 8°C e, preferencialmente, devem ser hermeticamente fechados para se evitar contaminação e ressecamento deles.
Meio Simples: possui os nutrientes essenciais para o crescimento dos micro-organismos pouco exigentes. Ex. Caldo Simples.
Meio Complexo ou Quimicamente não definido: contém ingredientes razoavelmente conhecidos (peptonas, extratos de carne e de levedura, etc.) porém a composição química pode variar.
Meio Enriquecido: além das fontes nutricionais usuais, são adicionados sangue, soro, ovo, extrato tecidual, etc., permitindo o crescimento de micro-organismos exigentes que necessitem de fatores de crescimento, mas não inibem o crescimento de outros. Ex. Ágar Sangue, Ágar Chocolate.
Meio Seletivo: a adição de certas substâncias químicas, como corantes, antibióticos e etc., favorece o crescimento de determinados micro-organismos em detrimento de outros. Ex. Ágar Mac Conkey, Ágar Salmonella-Shigella, Ágar Sabouraud.
Meio Diferencial: a incorporação de certos reagentes ou substâncias químicas ao meio evidenciam uma característica que permite diferenciar um grupo ou uma espécie de micro-organismos. Ex. Ágar Sangue, Ágar Mac Conkey.
1. Meios de Cultura para Transporte e Conservação
Princípio: meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável.
Utilidade: meio de transporte de fezes.
Interpretação: crescimento é indicado pela turbidez do meio. Após a incubação, semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou MacConkey.
Princípio: foi formulado a partir do meio de Stuart, uma vez que micro-organismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem nesse meio. É carente em fonte de nitrogênio, o que impede consideravelmente a multiplicação de micro-organismos, enquanto a composição nutritiva garante a sobrevivência deles. O que difere os meios Cary Blair e Stuart é a adição de uma solução salina balanceada de tampão fosfato inorgânico e a retirada da fórmula o azul de metileno no Cary Blair.
Utilidade: transporte de material fecal e conservação dos micro-organismos.
Interpretação: a cor original do meio é branca opalescente. Como esse é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.
Recomendações: não deixar o meio com a tampa aberta ou semiaberta após a semeadura e não semear fezes coletadas com mais de 6 horas.
Princípio: assim como o meio Cary Blair, a carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de micro-organismos, enquanto a composição nutritiva garante a sobrevivência deles.
Utilidade: transporte de diversos materiais e conservação dos micro-organismos. Conservação de micro-organismos patogênicos como: Salmonella spp., Shigella spp., Haemophilus spp., Streptococcus pneumoniae, entre outros.
Interpretação: a cor original do meio é branca opalescente. Como esse é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.
Recomendações: não deixar o meio com a tampa aberta ou semiaberta após a semeadura e não semear fezes coletadas com mais de 6 horas.
Princípio: é um meio simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de Microbiologia.
Utilidade: análise de água e de alimentos como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas a exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras. O uso mais frequente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da crio conservação (congelamento das cepas em freezer a – 70ºC). Também é usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram-positivos.
Interpretação: a cor original do meio é branca opalescente.
Positivo: crescimento na superfície do Agar.
Negativo: por ser um meio geral, não cabe fazer controle negativo.
Recomendações: por ser um meio nutritivo, a ausência de crescimento não deverá ocorrer.
2. Meios de Cultura para Crescimento e Isolamento
2.1 Caldo Selenito com Novobiocina
Princípio: Meio Enriquecido e Seletivo. Possui propriedades que inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos.
Utilidade: enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos.
Interpretação: a cor original do meio é vermelho tijolo.
Recomendações: não autoclavar, pois contém antibiótico.
Princípio: Meio Enriquecido e Seletivo. Os sais de bile inibem micro-organismos Gram-positivos. A adição da solução de iodo e de verde brilhante 0,1% inibe a flora intestinal normal de espécies fecais.
Utilidade: enriquecimento para Salmonella spp.
Interpretação: a cor original do meio é límpida com precipitado branco. O crescimento é indicado pela turbidez do meio. Após a incubação, semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou Mac Conkey.
Princípio: Meio Seletivo e Diferencial. O cristal violeta e os sais de bile inibem micro-organismos Gram-positivos, especialmente enterococos e estafilococos. Como a concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios, não é tão seletivo para Gram-negativos como, por exemplo, o Ágar SS, a seguir. A incorporação de lactose ao meio e a presença do indicador de pH vermelho neutro permitem diferenciar os micro-organismo em lactose positiva (bactérias que fermentam a lactose produzem ácido resultando em colônias de cor rosa), ou lactose negativa (bactérias que não fermentam a lactose formam colônias transparentes).
Utilidade: isolar bacilos Gram-negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose.
Interpretação: a cor original do meio é rosa avermelhado.
Há crescimento de bacilos Gram-negativos e não há crescimento de cocos Gram-positivos.
Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose; suspeita de E. coli, Proteus.
Colônias incolores: não fermentadoras de lactose; suspeita de Salmonella e Shigella.
2.4 Ágar Salmonella-Shigella (SS)
Princípio: Meio Seletivo e Diferencial. Os sais de bile, o verde brilhante e o citrato de sódio inibem os micro-organismos Gram-positivos. Assim como no Ágar Mac Conkey, a incorporação de lactose ao meio e a presença do indicador de pH vermelho neutro permitem diferenciar os micro-organismo em lactose positiva ou lactose negativa. O tiossulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H2S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro.
Utilidade: selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e água.
Interpretação: a cor original do meio é vermelha alaranjada.
Colônias com centro negro (H2S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella.
Colônias incolores: suspeita de Shigella spp.
Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp.
Recomendações: quando na ausência de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. Não autoclavar, pois a alta temperatura degrada o açúcar contido no meio.
Princípio: Meio Enriquecido, amplamente utilizado para o cultivo de micro-organismos exigentes, embora cresçam quase todos os tipos de micro-organismos. À base do meio é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho e levado para banho-maria a 80-85°C por 15 minutos, fazendo com que as hemácias lisem e liberem hemina e hematina, fundamentais para o crescimento dos micro-organismos exigentes.
Utilidade: crescimento de micro-organismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
Interpretação: a cor original do meio é castanho escuro (chocolate).
Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp.
Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.
Recomendações: como o meio é rico, crescem vários tipos de micro-organismos. Deve-se isolar a colônia em estudo, garantindo não estar trabalhando com cepas misturadas, e fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas, corando-as pela técnica de Gram, para confirmar se trata ou não de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram-negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram-negativos delicados e pleomórficos).
2.6 Ágar Thayer-Martin Chocolate
Princípio: Meio Seletivo, rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, pois contém antibióticos que inibem o crescimento de bactérias do gênero Neisseria saprófitas e outras bactérias.
Utilidade: isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.
Interpretação: a cor original do meio é castanho escuro (chocolate).
Colônias pequenas com pigmento creme: sugestivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.
Recomendações: fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas, corando-as pela técnica de Gram, para confirmar se trata ou não de Neisseria (diplococos Gram-negativos reniformes). Confirmando a morfologia pelo Gram, seguir identificação com testes de oxidase e provas de fermentação. Antes de semear o material biológico aquecer o meio de cultura em estufa a 35ºC, pois temperaturas baixas podem inibir o crescimento de Neisseria. Se não for incubado em CO2 e não houver crescimento, pode ser um resultado falso-negativo, pois bactérias do gênero Neisseria necessitam de atmosfera com o CO2 para o crescimento. Se não houver crescimento, incubar até 5 dias.
Princípio: Meio Enriquecido e Diferencial. Usa uma base rica, que oferece ótimas condições de crescimento à maioria dos micro-organismos. A conservação dos eritrócitos íntegros favorece a formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
Utilidade: isolamento de micro-organismos não fastidiosos. Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Usado também na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.).
Interpretação: a cor original do meio é vermelha.
Beta hemólise (lise total dos eritrócitos): presença de halo transparente ao redor das colônias. Ex. Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus.
Alfa hemólise (lise parcial dos eritrócitos): presença de halo esverdeado ao redor das colônias. Ex. Streptococcus pneumoniae.
Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias, eritrócitos permanecem íntegros.
Recomendações: não usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura, dificultando o estudo de hemólise. Não usar sangue humano, pois alguns micro-organismos não apresentam hemólise, gerando resultados falso-negativos. Não adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemácias rompem-se. Por ser um meio rico, o crescimento costuma ser abundante. Sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de identificação, garantindo não estar trabalhando com cepas misturadas.
2.8 Meio de Tioglicolato sem indicador
Princípio: Meio Enriquecido. As substâncias redutoras tioglicolato, cisteína e sulfito de sódio produzem uma anaerobiose suficiente para micro-organismos anaeróbios exigentes.
Utilidade: cultivo de micro-organismos anaeróbios, como Clostridium tetani, C. perfringens, C. butulinium.
Interpretação: a cor original do meio é amarelo-claro. O crescimento é indicado pela turbidez do meio.
Recomendações: não usar meios que estejam turvos. Se necessário, incubar por um período superior a 48 horas.
2.9 Caldo BHI – Brain Heart Infusion
Princípio: Meio Diferencial, derivado de nutrientes de cérebro e de coração, peptona e dextrose. A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. A dextrose é um carboidrato que os micro-organismos utilizam para fermentação.
Utilidade: cultivo de estreptococos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos. Pode ser utilizado na preparação do inoculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, para realização de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C e para teste de motilidade em lâmina.
Interpretação: a cor original do meio é amarelo-claro, límpido. O crescimento é indicado pela turbidez do meio.
Recomendações: para cultivo de anaeróbios, acrescentar 0,1% de Ágar. Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos é necessária adição de suplementos a base de L-cisteina, NAD (fator V) e hemina (fator X).
2.10 Ágar Cled – Cystine Lactose Electrolyte Deficient
Princípio: Meio Seletivo e Diferencial. Isolamento e quantificação de micro-organismos presentes em amostras de urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo, podendo assim verificar se o micro-organismo é lactose negativa ou positiva.
Utilidade: isolar e quantificar micro-organismos Gram-positivos, Gram-negativos e leveduras.
Interpretação: a cor original do meio é azul claro.
Colônias lactose positiva: cor amarela.
Colônias lactose negativa: cor azul.
A) Características de crescimento:
Escherichia coli: colônias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de diâmetro; as não fermentadoras de lactose formam colônias azuis.
Espécies de Klebsiella: colônias muito mucosas, cor variável de amarelo a branco azulado.
Espécies de Proteus: colônias azuis translúcidas, geralmente menor que E.coli.
Espécies de Salmonella: colônias planas, cor azul.
Enterococcus faecalis: colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de diâmetro.
Staphylococcus aureus: colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm de diâmetro.
Staphylococcus coagulase negativa: colônias amarelas palha e brancas.
Corynebacterium: colônias pequenas e cinza.
Lactobacilos: colônias pequenas e com superfície rugosa.
Pseudomonas aeruginosa: colônias verdes, com superfície prateada e periferia rugosa.
Observação: espécies de Shigella não crescem em meios deficientes em eletrólitos.
2.11 Meio Löwenstein Jensen
Princípio: Meio Enriquecido por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactérias e o crescimento e satisfatório para o teste de niacina (que e positivo para Mycobacterium tuberculosis).
Utilidade: isolamento primário das micobactérias.
Interpretação: a cor original do meio é verde-claro.
Positivo: crescimento de colônias amarelas.
Negativo: ausência de crescimento.
Recomendações: como é um meio rico em proteínas, bactérias proteolíticas contaminam o meio, liquefazendo-o, para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubação para tirar as culturas que possam ter contaminado. Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias desenvolvem-se lentamente. Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo Álcool Acido Resistente (BAAR), pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.
Princípio: Meio Seletivo. A Cicloheximida serve para selecionar fungos dermatófitos e o cloranfenicol para inibir o crescimento de bactérias e alguns fungos filamentosos.
Utilidade: isolamento de fungos patogênicos, principalmente dermatófitos.
Interpretação: a cor original do meio é amarelo claro opalescente. Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do micro-organismo que cresceu.
Recomendações: a ausência de crescimento não indica uma cultura negativa para fungos, pois alguns deles podem ter o crescimento inibido nesse meio. Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o meio contido em placas.
2.13 Ágar Sabouraud Dextrose
Princípio: Meio Enriquecido. Contém nutrientes que favorecem o crescimento de diversos fungos leveduriformes e filamentosos.
Utilidade: cultivo e crescimento de espécies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados a infecções superficiais. Caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante).
Interpretação: a cor original do meio é amarelo claro opalescente. Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do micro-organismo que cresceu.
Recomendações: recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o meio contido em placas. Não usar meios vencidos e/ou ressecados. Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI Ágar.
3. Meios Comerciais para Provas de Identificação
Princípio: capacidade de algumas bactérias de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono (meio não tem peptona), alcalinizando o meio.
Utilidade: diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.
Interpretação: a cor original do meio é verde.
Positivo: cor azul (alcalino) ou crescimento no local do inoculo.
Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada.
Se houver crescimento na área do inoculo sem mudança de cor, o teste pode ser considerado positivo; reincubar por 24 a 72 horas, podendo haver mudança de cor do meio para azul.
Recomendações: manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxigênio. Não transportar colônias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo. Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25°C) por até 7 dias. Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactéria. Não fazer inoculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo).
Princípio: capacidade de algumas bactérias hidrolisarem esculina em presença de bilis. As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS, são capazes de crescer em presença de sais biliares. A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina; esta reage com íons férricos (citrato férrico), formando um complexo negro.
Utilidade: separação dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa. Identificação dos Enterococcus spp., que são Bile-Esculina positiva.
Para identificação de bacilos Gram-negativos não fermentadores e enterobactérias, usar o meio sem bilis (prova de esculina).
Interpretação: a cor original do meio é acinzentada.
Positivo: enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio.
Negativo: ausência de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio após 72 horas de incubação.
Recomendações: para provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de incubação maior (48 horas). Alguns Streptococcus do grupo viridans podem hidrolisar a esculina em presença de bilis se incubados em atmosfera de CO2.
Princípio: interação da beta hemólise secretada pelo Staphylococcus aureus com o micro-organismo em estudo, que secreta uma proteína, “fator CAMP”, produzindo aumento de hemólise no local da inoculação.
Utilidade: separação do Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolíticos e espécies de Listeria.
Positivo: aumento da área de hemólise em forma de flecha no local onde estão mais próximas as duas estrias de crescimento.
Negativo: ausência desse aumento. Observa-se a hemólise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas.
Recomendação: não utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem não produzir beta hemolisina. Não tocar as estrias da semeadura das cepas, para não dar resultado falso -negativo. Não utilizar placas de Ágar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova.
Princípio: cepas de alguns micro-organismos produzem DNase e endonuclease termoestável, que hidrolisam o DNA do meio de cultura. Posteriormente esse meio é acidificado com HCl 1Npara a revelação da prova.
Utilidade: separa os principais micro-organismos de importância clínica:
DNase positivos: Staphylococcus aureus, Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis.
DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactérias, demais bacilos Gram-negativos não fermentadores.
A) Revelação com HCl 1 N: cor original do meio é amarelo-claro.
Positivo: presença de halo claro na parte inferior e em volta da colônia.
Negativo: ausência de halo claro em volta da colônia.
B) Revelação com azul de toluidina O: cor original do meio é azul claro
Positivo: presença de coloração rosa na parte inferior e em volta da colônia.
Negativo: ausência de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul.
Recomendações: usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova. Para a detecção da atividade de DNase não e necessário que haja crescimento, por isso e que semeadura deve ser de forma circular densa e não de estria.
3.5 Ágar TSI – Triplo Açúcar Ferro
Princípio: contém três açúcares: glicose, lactose e sacarose. Utiliza o indicador de pH vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos, que gera mudança da cor de vermelho ou púrpura (alcalino) para amarelo (ácido) e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (cor preta na base do tubo). Há duas câmaras de reação dentro do mesmo tubo. A porção inclinada ou bico, exposta ao oxigênio é aeróbia, enquanto a porção inferior, coluna ou fundo, está protegida do ar e é relativamente anaeróbia. Na coluna, há baixa concentração de O2 e, por isso, a utilização de glicose é preferencial.
Utilidade: diferenciar bacilos Gram-negativos com base na fermentação de carboidratos, na produção de sulfato de hidrogênio e de gás.
Interpretação: a cor original do meio é vermelha ou púrpura, levemente opalescente. Reações ápice/base:
Púrpura/amarelo: fermentação apenas da glicose.
Amarelo/amarelo: fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açúcares).
Presença de gás (CO2): bolhas ou meio fragmentado
H2S positivo: precipitado negro. Quando há H2S significa que a bactéria usou toda a glicose e acidificou o meio.
Recomendações: não realizar leitura com menos de 18 ou mais de 24 horas.
Princípio: habilidade de alguns micro-organismos metabolizarem o triptofano em indol, após a adição de reagentes de Erlich ou de Kovacs.
Utilidade: diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e anaeróbios.
Interpretação: após incubação, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs, dependendo reagentes da preferência dos Gram-negativos não fermentadores ou anaeróbios, que podem produzir mínima quantidade de indol.
H2S positivo: cor negra ao longo da linha de inoculação.
H2S negativo: linha ao longo da inoculação inalterada.
Indol positivo: anel vermelho logo abaixo da camada de xilol.
Indol negativo: permanecerá anel amarelo logo abaixo da camada de xilol.
Motilidade positiva: micro-organismos difundem-se no meio causando turbidez.
Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado apenas ao longo da linha do inoculo.
Princípio: capacidade de algumas bactérias de produzirem fenilalaninadesaminase, que age sobre a fenilalanina formando ácido fenilpirúvico. Esta, na presença de cloreto férrico, desenvolve uma coloração verde (garrafa) intenso.
Utilidade: diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.
Interpretação: adicionar diretamente o cloreto férrico no tubo inoculado, antes da interpretação do resultado e distribuir o reagente sobre a superfície do meio. A cor original do meio é amarelo-palha.
Positivo: coloração esverdeada na superfície do meio após a adição do cloreto férrico.
Negativo: o meio permanece amarelo, inalterado.
Recomendações: resultado positivo deve ser interpretado imediatamente após a adição do reagente (em até 5 minutos), pois a cor verde desbota rapidamente.
3.8 Ágar Base Ureia (Christensen)
Princípio: capacidade de alguns micro-organismos de utilizarem a uréase para degradar a ureia em duas moléculas de amônia, resultando na alcalinização do meio. A utilização do indicador de pH vermelho de fenol permite detectar a mudança de cor de amarelo para rosa (alcalino).
Utilidade: identificar bacilos Gram-negativos fermentadores e não fermentadores, Staphylococcus e Haemophilus.
Interpretação: a cor original do meio é amarelo-palha.
Positivo: alteração do meio para cor de rosa, pink.
Positivo rápido: 1 – 6 horas para Proteus spp.
Positivo tardio: 24 horas a 6 dias ou mais tempo de incubação para algumas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus.
Negativo: sem alteração de cor do meio.
Recomendações: não aquecer a solução base da ureia, pois ela pode se decompor. Não deixar o meio em temperatura ambiente pode ocorrer autohidrólise.
4. Produtos para Provas de Identificação
Princípio: presença, em alguns micro-organismos, da enzima catalase, que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio, formando bolhas. Para isso, faz-se um esfregaço (não precisa adicionar água na lâmina) e adiciona-se água oxigenada.
Utilidade: para Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis. Geralmente utilizada para diferenciar Streptococcus (catalase negativos) de Staphylococcus (catalase positivos).
Positivo: presença imediata de bolhas e efervescência.
Negativo: ausência de bolhas ou efervescência.
Recomendações: para o crescimento em cultura, evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrócitos podem produzir reação fraca de catalase, gerando resultados falso-negativos.
Princípio: presença, em alguns micro-organismos, da enzima catalase, que reage com o plasma sanguíneo através de um mecanismo similar ao da coagulação normal. Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada (prova em lâmina) e coagulase livre (prova em tubo).
Utilidade: diferenciar entre as espécies de Staphylococcus de importância clínica, S. aureus (coagulase positiva), das demais espécies (coagulase negativas).
Positiva: precipitado branco e aglutinação dos micro-organismos da suspensão, após 15 segundos, no círculo que contém o plasma.
Negativa: ausência de aglutinação no círculo que contém o plasma.
Controle sem plasma: deverá ser leitoso e uniforme, sem precipitado ou aglutinação, os quais tornam a prova inespecífica, devendo ser repetida a prova em tubo.
Positiva: presença de qualquer grau de coágulo.
Negativa: ausência de coágulo.
Recomendações: durante a leitura, inclinar o tubo delicadamente e não agitar, pois pode desmanchar os coágulos parcialmente formados. Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA e não recomenda-se o plasma humano, pois este contém quantidades variadas de Fator de Reação com a coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso-negativa.
Princípio: habilidade de alguns micro-organismos de produzir enzimas proteolíticas (gelatinase), que liquefazem/hidrolisam gelatina.
Utilidade: identificar e classificar bactérias fermentadoras.
Positivo: emulsão de gelatina (cor verde) na porção submersa do filme torna-se transparente (clara).
Negativo: fita permanece verde, emulsão esverdeada permanece na porção submersa do filme.
Recomendações: utilizar filme de Raio X não revelado.
Princípio: cepas produtoras de lecitinase produzem zona opaca ao redor do inoculo.
Utilidade: diferenciação de espécies de Bacillus e de Clostridium.
Interpretação: a cor original do meio é amarela.
Positivo: formação de halo branco ao redor das colônias.
Negativo: ausência de halo, meio fica inalterada.
Recomendações: não usar ovos velhos. Não usar meio vencido.
Princípio: produção intracelular da enzima oxidase por algumas bactérias.
Utilidade: ajuda caracterizar espécies de Neisseria e diferenciar não fermentadores (oxidase positivas) de enterobactérias (oxidase negativas). Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp.
Interpretação: a cor original meio é branca ou levemente azulada.
Oxidase positiva: produção de cor roxa imediatamente no local da inoculação da bactéria. Não considerar alteração de cor tardia.
Oxidase negativa: não há mudança da cor do papel no local da inoculação da bactéria.
Recomendações: não fazer o teste de colônias de crescimento de meios que contenham glicose, pois a fermentação o inibe a atividade da oxidase, podendo resultar em falso negativo. Não fazer teste de colônias de crescimento de meios seletivos (Mac Conkey, XLD, EMB), mas sim de meios não seletivos (Ágar sangue e Ágar chocolate). Os reagentes para oxidase, se auto oxidam rapidamente com o ar, perdendo a sensibilidade.
4.6 Fermentação de Carboidratos
Princípio: capacidade de alguns micro-organismo fermentarem um determinado carboidrato, enquanto outros não.
Utilidade: identificar e separar espécies de Enterococcus spp., Streptococcus spp. e Staphylococcus coagulase negativa.
Interpretação (meio comercial): a cor original do meio é púrpura ou alaranjado.
Positivo: crescimento bacteriano (turvação do meio) com viragem do indicador para amarelo.
Negativo: ausência de crescimento, o meio permanece com a cor original e sem turvação.
Recomendações: para provas negativas, incubar um período maior (48 horas). Não autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradá-lo.
Princípio: teste enzimático que consiste na hidrólise de um substrato por uma enzima bacteriana, com a liberação de outro substrato, que reage com PYR e é detectado com a formação de uma base de Schiff, de coloração vermelha.
Utilidade: teste presuntivo para identificar Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) e Enterococcus spp., identificação de algumas espécies Staphylococcus coagulase negativa e identificação de bacilos Gram-negativos não fermentadores.
Positivo: cor vermelho cereja em 1 minuto (após adicionar o reagente de PYR).
Negativo: sem alteração de cor.
Recomendações: para identificações presuntivas do Streptococcus pyogenes ou de Enterococcus spp., confirmar se realmente são cocos Gram-positivos catalase negativos, pois algumas cepas de Staphylococcus spp., Aerococos e Arcanobacterium haemolyticum, podem ser PYR positivos. Raras cepas de Enterococcus spp. podem ser catalase positiva, confirmar com outras provas (como bilis esculina) tratar de enterococo ou não. Não utilizar colônias com crescimento superior a 24 horas, culturas velhas podem dar resultado falso – negativo,e não exceder o tempo de leitura.
4.8 Crescimento a 42 E 44°C
Princípio: capacidade de alguns micro-organismo crescerem em altas temperaturas.
Utilidade: identificação de bacilos Gram-negativos não fermentadores.
Interpretação: a cor original do meio é púrpura.
Positivo: turvação e viragem do indicador de púrpura para amarelo.
Negativo: ausência de turvação e permanência da cor púrpura.
Recomendações: não fazer inoculo muito denso, pode resultar em falsa turvação. Importante o controle da temperatura do banho, com termômetro de máxima e mínima.
Princípio: flagelos ocorrem nos bacilos Gram-negativos; poucas formas de cocos são moveis. A bactéria pode conter um ou muitos flagelos e sua localização varia com a espécie da bactéria e com as condições de cultura.
Utilidade: determinar se o micro-organismo é ou não móvel.
Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade), MILI (Motilidade, Indol, Lisina), MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobacterias.Meio motilidade em caldo utilizado para não fermentadores e Enterobacter cloacae (em casos de dúvidas).
Motilidade positiva: organismos móveis migram pela linha do inoculo e difundem-se no meio, causando turbidez.
Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado apenas ao longo da linha de inoculo.
Recomendações: a temperatura de incubação é extremamente crítica, porque muitos micro-organismos são móveis a 15-25°C e no móveis a 37°C. Se houver suspeita que o micro-organismo pode exibir motilidade em baixa temperatura, inocular dois tubos simultaneamente, um a 35°C e outro a temperatura ambiente 22-25°C. Os testes de motilidade em anaeróbios são difíceis de serem interpretados, sendo significativos apenas os resultados positivos.
4.10 Prova de Tolerância ao NaCl 6,5%
Princípio: verificar a capacidade de alguns micro-organismos crescerem em presença do sal. O meio base utilizado é o BHI caldo, que e um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactérias. Esse meio normalmente contém 0,5 % de NaCl e aumenta-se para 6,5 %, tornando um meio semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns micro-organismos.
Utilidade: separa Enterococcus spp., que são NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que são NaCl 6,5% negativos. Identificação de bacilos Gram-negativos não fermentadores.
Interpretação: a cor original do meio é amarelo ou purpura, dependendo do uso do indicador na composição.
Positivo: turvação do meio com ou sem viragem do indicador.
Negativo: ausência de crescimento. O meio permanece com a cor original e sem turvação.
Recomendações: para provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de maior (48 horas). Verificar a quantidade de NaCl contido na fórmula do meio de BHI. Não carregar no inoculo, pois o excesso poderá ser interpretado como crescimento e dar resultados falso – positivos. Os Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e ocasionalmente os Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) podem ser tolerantes ao NaCl 6,5%. Utilizar outras provas para confirmar a identificação destas espécies.
5. Discos para Identificação
Princípio: Streptococcus beta hemolítico do grupo A são sensíveis a concentrações baixas de Bacitracina.
Utilidade: identificação presuntiva de Streptococcus beta hemolítico do grupo A (S. pyogenes).
Positivo (Sensível): presença de qualquer halo ao redor do disco.
Negativo (Resistente): ausência de halo ao redor do disco.
Recomendações: não existem dados disponíveis que indiquem a necessidade de medir os halos de inibição. O inoculo bacteriano deve ser confluente, inoculo muito diluído pode permitir que os Streptococcus não pertencentes ao grupo A pareçam sensíveis a bacitracina.
Princípio: separa espécies de Staphylococcus coagulase negativa que podem ser sensíveis ou não à Novobiocina.
Utilidade: separa cepas de Staphylococcus saprophyticcus (Novobiocina resistentes) das demais cepas de Staphylococcus coagulase negativa de importância clínica.
Resistente: ausência de halo de inibição ou halos igual ou inferior a 15 mm.
Sensível: presença de halo de inibição igual ou superior a 16 mm.
Recomendações: se necessário usar cepas velhas (com crescimento superior a 24 horas), semear em caldo BHI ou TSA e incubar a 37oC até turvar, acertar a turvação na escala 0,5 de MacFarland para fazer o teste. Para cepas isoladas de outros materiais biológicos que não urina, fazer identificação complementar com fermentação de açúcares para confirmar espécie.
Princípio: optoquina inibe de forma seletiva o crescimento de Streptococcus pneumoniae em concentrações muito baixas (5 μg/mL ou menores). As células do Streptococcus pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise, devido à variação da tensão superficial, e é produzida uma área de inibição.
Utilidade: separa Streptococcus pneumoniae dos demais Streptococcus alfa hemolíticos.
Positivo (Sensível): disco de 6 mm: halo de inibição de 14 mm ou mais; disco de 10 mm: halo de inibição de 16 mm ou mais.
Negativo (Resistente): disco de 6 mm: halo de inibição inferior a 14 mm ou ausência de halo; disco de 10 mm: halo de inibição inferior a 16 mm ou ausência de halo.
Recomendações: a optoquina pode inibir outros Streptococcus do grupo viridans, mas apenas em concentrações muito elevadas.
Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos, disponível em http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2004.pdf, acesso em 21/01/2015.
