#spread plate

Postingan pertama blog ini sudah membahas tentang EKG, proses pemanenan dan pengemasan. Nah sekarang hasil yang diperoleh dari fermentasi oleh P. polymyxa perlu diuji untuk mengetahui "sebenarnya berapa banyak bakteri sih yang ada pada EKG?" dan juga "apakah hasil APH dalam bentuk broth termodifikasi memiliki kualitas standar.

Maka dari itu, perlu yang dilakukan quality control dari hasil pembuatan APH P. polymyxa. Metode serial dilution, spread plate, dan colony forming counting adalah metode kuantitatif viabilitas sel bakteri yang digunakan untuk mengetahui kualitas APH.

Terdapat banyak metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel bakteri secara kuantitatif. Metode penghitungan langsung (Petroff-Hausser) sulit dilakukan mengingat bakteri perlu difiksasi untuk dihiting dengan baik. Electronic Cell Counter adalah instrumen yang dapat menghitung sel tersuspensi pada cairan konduktor, daya hambat meningkat apabila jumlah sel juga meningkat. Analisis spektrofotometrik dapat digunakan sebagai indeks pertumbuhan, semakin tinggi jumlah sel maka foton yang diterima akan semakin sedikit. Analisis spektrofotometri menawarkan hasil yang cepat tetapi terbatas terhadap sensitivitas deteksi sel yang lebih dari 10^7 CFU, serta memerlukan kalibrasi spektrofotometrik terlebih dahulu. Metode yang lebih praktis dengan menggunakan serial dilution-agar plate analysis, yaitu metode pengenceran suspensi yang nantinya ditumbuhkan pada media dengan teknik spread plate.

Serial Dilution of Filthy Broth Samples

Metode pengenceran bertingkat memerlukan sampel suspensi bakteri, media agar steril yang sudah di-plating, mikropipet dan tip 1 ml steril, api bunsen, tabung reaksi berisi aquadest 9 ml. Serial dilution dimulai dari

Homogenisasi sampel untuk memastikan sel terdispersi, kemudian pengambilan 1 ml sampel APH yang akan dicampurkan pada tube 1 (10^-1), lalu dilakukan pippeting & diluting memastikan larutan homogen.

Tube 2 berisi aquadest 9 ml diisi dengan hasil campuran pada tube 1 dengan sebanyak. Disinilah kenapa disebut pengenceran bertingkat, karena hasil dari campuran pada tube 2 akan dicampurkan pada tube 3 dan seterusnya dengan pola 9 ml+ 1 ml.

Pengenceran dapat dilakukan secara opsional hingga pengenceran 10^-7, tetapi dapat dilakukan hanya sampai 10^-5 tergantung berdasarkan sampel yang dipakai atau literatur yang diikuti sebagai acuan.

Spread Plate of Diluted APH Suspension

Suspensi yang sudah diencerkan akan dibiakkan pada media nutrient agar untuk melihat jumlah sel yang hidup pada suspensi. Spread Plate dilakukan dengan cara tahap yang prosedural dimulai dari

Persiapkan suspensi bakteri yang telah diencerkan.

Bakar triangle glass rod atau L glass rod dengan bunsen.

Ambil sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri hasil pengenceran menggunakan mikropipet dan tip, lalu dituangkan pada media agar.

Gunakan triangle glass rod yang sudah dingin untuk menyebarkan suspensi cairan pengenceran keseluruh bidang agar.

Segel cawan petri lalu inkubasikan selama 2x24 jam tetapi setiap 24 jam tetap diamati.

Quebec Colony Counter - Viable Bacteria Counting

Inkubasi yang telah dilewati akan menimbulkan bakteri yang akan terlihat tumbuh. Penghitungan dilakukan dengan bantuan colony counter yang tersedia di tempat magang. Secara statistik, jumlah koloni bakteri yang valid adalah yang memiliki value diantara 30 hingga 300 secara statistik. Petri yang memuat >300 koloni terkategorikan sebagai TBUD (terlalu banyak untuk dihitung) atau TNTC (too numerous to count), jika memuat <30 maka terkategorikan sebagai TSUD (terlalu sedikit untuk dihitung) atau TFTC (too few to count). Cara menghitung jumlah sel per ml sampel dengan memasukkan jumlah koloni terbentuk pada rumus:

CFU/ml = (Jumlah koloni x faktor pengenceran) : volume spread plate

CFU adalah singkatan dari Colony Forming Unit artinya jumlah koloni yang terbentuk akibat dari satuan sel yang viable dan mampu hidup dengan baik. Masih bingung dengan cara menghitung CFU/ml suatu sampel??? Yuk simak video ini supaya bisa lebih paham!!!

References:

Cappucino, J. G., & Welsh, C. (2019). Microbiology: a laboratory manual (12th ed.). Pearson.

Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., & Gilmore, M. S. (1997). Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques, 23(4), 648-650.