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A eletroforese em gel de agarose é uma técnica de manipulação de DNA utilizada pela Engenharia Genética. Esse procedimento é feito com o intuito de separar, identificar e analisar fragmentos de DNA.
Imagem: Wikimedia Commons
Procedimento Operacional PadrĂŁo - Eletroforese
1 Objetivo
Ă objetivo deste POP padronizar metodologia de eletroforese em gel de agarose para separação de molĂ©culas, envolvendo a migração de partĂculas quando da aplicação de uma diferença potencial.
2 Campo de aplicação
Este procedimento aplica-se a disciplina de estĂĄgio supervisionado de biotecnologia.
3 Descrição
3.1 Materiais utilizados
a) tampĂŁo de eletroforese (Tris-acetato-EDTA - TAE ou Tris-borato-EDTA - TBE);
b) tampão de corrida (Migração: azul de bromofenol - 300bp e xileno cianol - 4000bp);
c) brometo de etĂdeo;
3.2 Equipamentos e utensĂlios
a) cuba de eletroforese;
b) fonte de força;
c) bandejas de gel (diferentes tamanhos e de plĂĄstico transparente Ă UV);
d) pentes (para fazer poços);
e) transiluminador;
f) pipetas de precisĂŁo;
g) béqueres de 500 mL;
h) erlenmeyers de 500 mL;
i) pipetador automĂĄtico;
4 Metodologia
4.1 Preparo de gel de agarose (0,8%)Â
a) Para 100 mL de gel, pesar:
agarose........................8 g
b) adicionar 100mL de TAE 1X;
c) fundir a solução no microondas atĂ© homogeneizar (aproximadamente 1 min e 10 seg na potĂȘncia mĂĄxima â evitar fervura);
d) enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba;
e) acrescentar 4”L de Brometo de EtĂdeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve;
obs.: brometo de etĂdio Ă© mutagĂȘnico e deve ser manuseado com luvas.
f) despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas;
g) colocar o pente da espessura desejada no suporte;
obs.: verificar o nĂșmero e o volume das amostras para escolher o pente mais adequado.Â
h) esperar a solução solidificar;
i) colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese;
j) adicionar tampĂŁo TAE 1X atĂ© cobrir a superfĂcie do gel.
4.2 AnalĂtica
k) extrair 3”L da amostra de DNA;
l) homogeinizar com 1”L de tampão de corrida 5X (Loading Buffer);
m) aplicar as amostras nos poços;
n) reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb);
o) ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V);
p) analisar o gel sob radiação ultravioleta (Alpha Imager);
q) tirar foto dos resultados obtidos;
4.3 Preparativa
r) adicionar tampão de corrida ao material a ser purificado (diluição de 5X);
s) aplicar as amostras nos poços, pulando um poço entre cada amostra para evitar contaminação;
obs.: para volumes maiores, montar o gel com o pente de dentes largos ou unir os dentes do pente com fita adesiva antes de colocar o pente no gel ainda lĂquido (morno).
t) aplicar em outro poço o padrão de tamanho molecular (Ladder-1kb);
u) ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V);
v) vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo;
w) cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e colocĂĄ-la em um tubo de microcentrĂfuga previamente pesado;
x) seguir protocolo de Purificação de DNA a partir de Gel.Â
4.4 SoluçÔes
y) TampĂŁo de corridaÂ
Solução TAE 1X (TampĂŁo Tris-Acetate - Tris 40mM, Ac. Acetico 20mM,EDTA 1mM)Â
diluir a solução estoque 50x em ĂĄgua Milli-Q.Â
z) TAE 50XÂ
(Solução estoque) p/ 1LÂ
Trizma-Base   242,0gÂ
Ăcido acĂ©tico glacial   57,1mLÂ
EDTA 0.5M pH 8.0 Â Â 100,0mLÂ
ĂĄgua q.s.p. Â Â 1000,0mLÂ
aa) TampĂŁo de amostra 5XÂ
(Loading Buffer) p/ 50mLÂ
Glicerol (50%) Â Â 25,0mLÂ
Azul de Bromofenol (0.125%) Â 0,0625gÂ
Xileno Cianol (0.125%) Â Â 0,0625gÂ
TE pH8,0 q.s.p. Â Â 50,0mLÂ
bb) PadrĂŁo de tamanho molecularÂ
(Ladder-1kb) (0,1”g/”L)
Ladder 1kb (Gibco BRL - 1”g/”L)  100”LÂ
TampĂŁo (Tris 10mM pH7,5, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM)  500”LÂ
Loading Buffer 5X   400”L
cc) Brometo de etĂdeo (10mg/mL)Â
Brometo de etĂdeo   1gÂ
Ăgua Milli-Q q.s.p. Â Â 100mLÂ
Agitar durante 16 horas, guardar a 4°C.Â
obs.: concentração no gel: 5”g/mL