#eletroforese

A eletroforese em gel de agarose é uma técnica de manipulação de DNA utilizada pela Engenharia Genética. Esse procedimento é feito com o intuito de separar, identificar e analisar fragmentos de DNA.

1 Objetivo

É objetivo deste POP padronizar metodologia de eletroforese em gel de agarose para separação de moléculas, envolvendo a migração de partículas quando da aplicação de uma diferença potencial.

2 Campo de aplicação

Este procedimento aplica-se a disciplina de estágio supervisionado de biotecnologia.

3 Descrição

3.1 Materiais utilizados

a) tampão de eletroforese (Tris-acetato-EDTA - TAE ou Tris-borato-EDTA - TBE);

b) tampão de corrida (Migração: azul de bromofenol - 300bp e xileno cianol - 4000bp);

c) brometo de etídeo;

3.2 Equipamentos e utensílios

a) cuba de eletroforese;

b) fonte de força;

c) bandejas de gel (diferentes tamanhos e de plástico transparente à UV);

d) pentes (para fazer poços);

e) transiluminador;

f) pipetas de precisão;

g) béqueres de 500 mL;

h) erlenmeyers de 500 mL;

i) pipetador automático;

4 Metodologia

4.1 Preparo de gel de agarose (0,8%) 

a) Para 100 mL de gel, pesar:

agarose........................8 g

b) adicionar 100mL de TAE 1X;

c) fundir a solução no microondas até homogeneizar (aproximadamente 1 min e 10 seg na potência máxima – evitar fervura);

d) enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba;

e) acrescentar 4µL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve;

obs.: brometo de etídio é mutagênico e deve ser manuseado com luvas.

f) despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas;

g) colocar o pente da espessura desejada no suporte;

obs.: verificar o número e o volume das amostras para escolher o pente mais adequado. 

h) esperar a solução solidificar;

i) colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese;

j) adicionar tampão TAE 1X até cobrir a superfície do gel.

4.2 Analítica

k) extrair 3µL da amostra de DNA;

l) homogeinizar com 1µL de tampão de corrida 5X (Loading Buffer);

m) aplicar as amostras nos poços;

n) reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb);

o) ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V);

p) analisar o gel sob radiação ultravioleta (Alpha Imager);

q) tirar foto dos resultados obtidos;

4.3 Preparativa

r) adicionar tampão de corrida ao material a ser purificado (diluição de 5X);

s) aplicar as amostras nos poços, pulando um poço entre cada amostra para evitar contaminação;

obs.: para volumes maiores, montar o gel com o pente de dentes largos ou unir os dentes do pente com fita adesiva antes de colocar o pente no gel ainda líquido (morno).

t) aplicar em outro poço o padrão de tamanho molecular (Ladder-1kb);

u) ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V);

v) vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo;

w) cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e colocá-la em um tubo de microcentrífuga previamente pesado;

x) seguir protocolo de Purificação de DNA a partir de Gel. 

4.4 Soluções

y) Tampão de corrida 

Solução TAE 1X (Tampão Tris-Acetate - Tris 40mM, Ac. Acetico 20mM,EDTA 1mM) 

diluir a solução estoque 50x em água Milli-Q. 

z) TAE 50X 

(Solução estoque) p/ 1L 

Trizma-Base     242,0g 

Ácido acético glacial     57,1mL 

EDTA 0.5M pH 8.0     100,0mL 

água q.s.p.     1000,0mL 

aa) Tampão de amostra 5X 

(Loading Buffer) p/ 50mL 

Glicerol (50%)     25,0mL 

Azul de Bromofenol (0.125%)   0,0625g 

Xileno Cianol (0.125%)     0,0625g 

TE pH8,0 q.s.p.     50,0mL 

bb) Padrão de tamanho molecular 

(Ladder-1kb) (0,1µg/µL)

Ladder 1kb (Gibco BRL - 1µg/µL)   100µL 

Tampão (Tris 10mM pH7,5, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM)   500µL 

Loading Buffer 5X     400µL

cc) Brometo de etídeo (10mg/mL) 

Brometo de etídeo     1g 

Água Milli-Q q.s.p.     100mL 

Agitar durante 16 horas, guardar a 4°C.