Real time tumbling: andare in ufficio con una giornata così sarebbe stato un delitto
Intanto le creature del sottosuolo.
Lo so che mi sto dando troppo credito e che mi sto mettendo in una situazione imbarazzante per diverse ragioni...
Ma spiegacelo.
Mica semplice...
Allora, cerchiamo di fare un po' di confusione: quella nell'immagine è l'interfaccia del software Prairie View, software di controllo di una parte hardware, nello specifico un microscopio a 2 fotoni. Come funziona un microscopio a 2 fotoni è un po' complesso da spiegare se non si ha una conoscenza almeno base del principio di fluorescenza, ma per ora limitiamoci a dire che sfrutta un laser a infrarossi (questo nello specifico ha due sorgenti laser, una che può essere settata su più lunghezze d'onda dai 700 nm al 1300 nm, e una fissa a 1040 nm) che attraverso un gioco di specchi e filtri va a colpire il campione di interesse, in questo caso un campione istologico, un agoaspirato di fegato umano adagiato su un classico vetrino da analisi istologica. Il campione colpito dal laser emetterà a sua volta una radiazione luminosa, che verrà captata dall'obiettivo del microscopio e, attraverso diverse componenti elettroniche, tradotta in una immagine. Ora, una cosa fondamentale da capire è che non esistono oculari nel microscopio a 2 fotoni (per capirci quelle cose dove classicamente in un microscopio ci si avvicina con gli occhi per guardare il campione), si tratta infatti di un microscopio a scansione, cioè la generazione dell'immagine è mediata da componenti elettroniche (ma no, non è un microscopio elettronico, quello è ancora un passo in più, si tratta comunque di un microscopio ottico): la radiazione luminosa emessa dal campione viene direttamente convertita in segnale digitale e tradotta in immagine attraverso il computer (non mi dilungo e semplifico mostruosamente, non crocefiggetemi). Questa immagine ottenuta dalla scansione puntiforme è quella che vedete nei tre pannelli in blu, verde e rosso; diciamo che in teoria il laser illumina del campo visivo quello che corrisponde alla grandezza di un pixel per volta (quanto è grande un pixel? Dipende dalle componenti fisiche del microscopio, nello specifico dall'obiettivo e dalle impostazioni che si danno), e in base alla velocità del meccanismo motorizzato del microscopio avremo le immagini in un tempo minore o maggiore. Nella finestra in grigio a sinistra c'è un piccolo riquadro giallo dove sono riportati le velocità di acquisizione: line period, frame period, frame rate; in questo caso, siccome per ogni campo visivo (field of view, FOV) prendiamo immagini con una risoluzione non altissima 256x256 pixel (si tratta di sezioni molto grandi, quindi molti FOV, questa nello specifico ha 240 FOV, per ogni FOV 19 piani, per piani, o z, si intendono diverse profondità di acquisizione, quindi un totale di 4560 immagini, per questo si fa il compromesso di scendere di risoluzione, sia per grandezza dati, sia per tempi di acquisizione molto lunghi), il tempo per ogni FOV che prende una porzione di 812,5 micrometri x 812,5 micrometri è di 418,253 ms, un po' meno di mezzo secondo. In totale, considerando che si acquisisce mettendo una sovrapposizione tra i diversi campi di acquisizione in modo da avere una immagine finale senza buchi, fotografiamo un'area di circa 1 cm per 1,7 cm con la risoluzione di 3,174 micrometri, non male.
Perché abbiamo 3 colori? Si tratta dei tre canali di acquisizione, vi riporto gli intervalli delle lunghezze d'onda come nota di colore (ah battutona) che vengono distribuite nei diversi canali di acquisizione: blu 410-495 nm, verde 495-560 nm, rosso 560/640 nm. In questo caso ho utilizzato solo una sorgente laser, quella modificabile (in gergo tunabile), settata a 920 nm. Con questa lunghezza d'onda sto eccitando un campione tal quale, non colorato con agenti esterni, ma semplicemente fissato per la conservazione, tagliato e messo su vetrino. Dovete sapere che le molecole contenute nei tessuti possono di per sé, se correttamente eccitate (e in questo il laser pulsato presente nel microscopio a 2 fotoni è molto bravo, sì, pulsato che eccita, e via battute cretine), emettere radiazioni luminose senza utilizzare colorazioni esterne. Nello specifico in blu vedete principalmente il collagene (che emette grazie al principio della seconda armonica, che non vi spiego qui perché è complesso e lungo e che soprattutto potete trovare spiegato molto meglio altrove), in verde autofluorescenza generica e in rosso autofluorescenza (pare) legata alla bilirubina. Le finestre in basso sono: a sinistra la sovrapposizione dei tre canali di fluorescenza, a destra la griglia di acquisizione di tutta la sezione su vetrino (i quadratini rossi sono i FOV, come vedete hanno delle sovrapposizioni, da setting 10%). Come da una eccitazioni a 920 nm si arrivi ad emissioni tra i 410 nm e i 640 nm, beh è il miracolo dei due fotoni, principio tra l'altro ipotizzato per la prima volta da una donna.
Ho confuso a sufficienza le idee?
Il famoso spiegone (fatto male).
